反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。

    固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無機(jī)－有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點和缺點。

    反相色譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時候這些添加物有可能會污染鍵合相表面。

硅膠表面因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。因為硅烷醇的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。

    使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護(hù)HPLC柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。

    當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓問題。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。這部分的"柱子觀察"將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來的或差不多原來的狀態(tài)。因為鍵合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。

    什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強的保留而且流動相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實驗才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。

    有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時間會波動，拖尾會出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。

     清洗硅膠鍵合柱子

     再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コＨ绻廴臼且驗橹貜?fù)進(jìn)樣時強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑）沖洗20個體積可以清除污染物。（表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個體積以后才更換強溶劑。

    有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子樂，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過一個或多個另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。

    一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，經(jīng)常最后一個溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。

    對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：

    100％甲醇

    100％乙晴

    75％乙晴－25％異丙醇

    100％異丙醇

    100％二氯甲烷

    100％正己烷

    用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速來沖洗，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動相，最后回復(fù)起始流動相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（DMSO）或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。

    問：用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?

    答：關(guān)于漂移問題：

    1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定

    2、流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

    3、柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡

    關(guān)于快速變化問題

    1、流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定

    2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。

    3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

問：液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

    答：1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。

    2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子

    問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

    答：

    1、樣品量不足：解決辦法為增加樣品量

    2、樣品未從柱子中流出：可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子

    3、樣品與檢測器不匹配：根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器

    4、檢測器衰減太多：調(diào)整衰減即可。

    5、檢測器時間常數(shù)太大：解決辦法為降低時間參數(shù)

    6、檢測器池窗污染：解決辦法為清洗池窗。

    7、檢測池中有氣泡：解決辦法為排氣。

    8、記錄儀測壓范圍不當(dāng)：調(diào)整電壓范圍即可。

    9、流動相流量不合適：調(diào)整流速即可。

    10、檢測器與記錄儀超出校正曲線：解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

    問：做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?

    答：原因可能有：

    1、泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理；

    2、比例閥失效，更換比例閥即可。

    3、泵密封墊損壞，更換密封墊即可。

    4、溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；

    5、系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可。

    6、梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

    問：我最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么?

    答：這是因為被分析物可能具有形成氫健的能力。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ODS柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺(TEA)，將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。

    問：我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么?

    答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。

    1、拆去保護(hù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；

    2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。

    3、將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，(此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動性)。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；

    4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明你的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。