孔雀石綠（MG）為三苯甲烷類工業(yè)染料, 在水產養(yǎng)殖上可以有效的預防與治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小蟲病。并常用于魚苗的消毒。但一些水產品販運商為保持水產品新鮮度普遍用MG消毒車廂和活魚池；酒店為了延長魚的存活時間也在魚池中投放MG進行消毒。使用MG消毒后的魚即使死亡后顏色也較為鮮亮，消費者很難從外表進行辨認。MG在水生生物體中的主要代謝產物為無色孔雀石綠（LMG）。MG具有毒性強、高殘留和致畸、致癌、致突變等副作用。LMG由于不溶于水，其殘留毒性比MG更強。所以，目前世界上諸如美國、日本、加拿大和歐盟等許多國家已將MG列為水產養(yǎng)殖禁用藥物，我國也于2002年5月將其列入“食品動物禁用的獸藥及其化合物清單”（1）。雖然MG已被列為水產養(yǎng)殖禁用藥物，但因為其價格低廉，同時目前在水霉病防治上尚無其它有效藥品，因此仍有一些水產養(yǎng)殖戶在普遍使用。
各類水產品中MG和LMG的檢測是我國食品衛(wèi)生學面臨的新課題。為此，我國農業(yè)部2004年頒布了水產品中MG殘留量測定的行業(yè)標準檢驗法-液相色譜法（SC/T3021-2004）（2）；國家質量監(jiān)督檢疫總局和國家標準化管理委員會于2005年亦發(fā)布了“液相色譜-串聯(lián)質譜法”和“高效液相色譜法”（（GB/T19857-2005）（3）的標準檢驗法。Chang-Jun Cha等報道了（2001）采用氰基柱的反相高效液相色譜法和液質聯(lián)機檢測MG（4）。
在上述分析方法中，SC/T3021-2004采用C18柱，等梯度洗脫方式，但需要較大流速（2ml/min）；而 GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脫方式。文獻（4）采用氰基柱分離的梯度洗脫方式。我們在研究這些分析方法的基礎上，采用氰基柱分離、流速為1.0mL/min的等梯度洗脫方式，具有保留時間短、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑；最低檢測濃度無LMG為0.02μg/mL，MG為0.05μg/mL。精密度高；特別是線性范圍達0.1μg/mL～160.0μg/mL，遠遠大于 SC/T3021-2004線性范圍（MG 0.01μg/m L～0.4μg/mL；LMG0.02μg/mL～0.40μg/mL）。而且，等梯度洗脫方式又擴大了液相色譜的應用范圍。現(xiàn)將結果報告如下：
1. 材料與方法
1. 1材料
1.1.1試劑
乙睛 色譜純，fishte ；
乙酸銨 ，hplc純 ，DIKMA；
孔雀石綠（MG） sigma試劑；
無色孔雀石綠（LMG） sigma試劑。
0.125mol/L乙酸銨溶液 稱取乙酸銨9.64 g，用純水溶解并定容至1000mL。用0.45μm濾膜過濾。
MG標準儲備液 準確稱取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100 mL。該標準溶液濃度為1mg/mL。避光、冰箱冷凍層保存。
MG標準應用液 吸取1mg/mL孔雀石綠標準儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
LMG標準儲備液 準確稱取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100mL。該標準溶液濃度為1mg/mL。
LMG標準應用液 吸取1mg/mL無色孔雀石綠標準儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。
MG和LMG標準混合溶液 分別吸取MG和LMG標準儲備液，用乙睛稀釋成不同濃度的標準混合溶液。
1.1.2 儀器
高效液相色譜儀。
1.2 步驟
1.2.1 色譜條件
檢測器 紫外-可見光檢測器，波長618nm；
色譜柱 氰基柱，4.6mm×250mm，5μm；
流動相 乙睛-0.125mol/L乙酸銨（pH4.5）=（47+53）；
柱溫 35℃；
進樣量 20μL。
1.2.2 測定步驟
吸取MG和LMG標準混合溶液（5.0μg/mL）注入色譜儀，在上述色譜條件下，繪制色譜圖。見圖1。
圖1. 5.0μg/mL孔雀石綠和無色孔雀石綠
標準混合溶液色譜圖
2.結果與討論
2.1流動相的選擇 MG和LMG的HPLC法分離，無論是C18柱還是氰基柱，多采用乙睛和乙酸銨作流動相的反相體系（1～4）。其中乙酸銨濃度對MG和LMG的分離有很大影響。對于梯度洗脫方式多采用50mmol/L乙酸銨溶液（2、3），而等梯度洗脫方式乙酸銨溶液濃度較大（0.125mol/L）（1）。
2.2 流動相溶劑比例的影響 在上述色譜條件下，用1.0μg/mL MG和LMG標準混合溶液在不同比例（V/V）乙睛-0.125mol/L乙酸銨溶液中觀察分離效果，結果表明，在乙睛-乙酸銨溶液（pH4.5）=47+53時分離效果好，靈敏度最高，所以選擇該溶劑比為流動相為。見表1。
表1 流動相溶劑比例對LMG/MG分離的影響
ACN/0.125mol/L乙酸銨 LMG MG
（V/V） TR（min） A TR（min） A ΔTR（min）
40/60 10.56 65364 15.06 94433 7.1
45/55 9.06 66962 13.14 111812 4.1
47/53 8.70 67011 11.21 11.5076 2.5
50/50 7.25 56335 8.51 99594 1.3
55/45 6.62 —— 7.08 —— 0.4
2.3最低檢測濃度 在上述色譜條件下，以3S/N的響應信號為最低檢測濃度，LMG的最低檢測濃度為0.02μg/mL，MG的最低檢測濃度為0.05μg/mL。均能滿足試驗要求。見圖2。
由圖可見，以取樣量10.0g計，最低檢測濃度LMG為2μg/kg，MG為5μg/kg。
圖2 LMG和MG最低檢測濃度
2.4 線性范圍試驗 在上述色譜條件下，LMG和MG線性關系均良好。LMG和MG線性范圍為2μg/mL～160.0μg/mL，r ＞0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL～10.0μg/mL范圍的校正曲線見圖3；1.0μg/mL～160.0μg/mL范圍的校正曲線見圖4。
(a) (b)
圖3 LMG（a）和MG（b）校正曲線1（0.2μg/mL～10.0μg/mL）
（c） （d）
圖4 LMG（c）和MG（d）校正曲線2（1.0μg/mL～160.0μg/mL）
2.5精密度試驗
在上述色譜條件下，分別用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合標準溶液進行平行性測定。保留時間相對標準偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面積相對標準偏差小于5%。見表2。
表2 不同濃度LMG/MG混合標準溶液測定精密度試驗
LMG/MG LMG MG
（μg/mL） TR A TR A
1.0 9.13 94326 11.84 121590
9.11 91624 11.82 124395
9.15 86984 11.82 126714
9.10 94254 11.77 115168
9.07 90030 11.73 115915
9.12 88426 11.75 118041
X 9.11 90940 11.78 120303
S 0.02730 3023.7 0.04450 4695.3
RSD（%） 0.3 3.3 0.4 3.9
5.0 9.01 346190 11.75 586155
8.91 334347 11.60 554314
8.89 350486 11.57 566958
9.07 337691 11.78 586993
9.06 333978 11.80 569882
9.01 328756 11.66 577275
X 8.99 338575 11.69 573596
S 0.07196 8198.3 0.09709 12493.2
RSD（%） 0.8 2.4 0.8 2.2
10.0 8.97 653769 11.63 1117447
9.03 689863 11.70 1147167
9.04 693111 11.71 1140571
9.00 681749 11.65 1264160
9.01 678101 11.67 1123467
X 9.01 679318.6 11.68 1158562
S 0.0270 15504.7 0.02750 60263
RSD(%) 0.3 2.3 0.2 5.0
3樣品測定
3.1 樣品處理
3.2樣品測定
3.2.1校正曲線的繪制
3.2.2樣品測定
3.3 加標回收率測定
4結論
LMG和MG毒性強、具有很高的三致作用，其對水產品的人為污染應受到嚴重關切。
LC5500高效液相色譜儀測定水產品中LMG和MG，具有方法簡便、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑、精密度高、靈敏準確、線性范圍寬等優(yōu)點，適用于水產品中LMG和MG含量檢測。