摘要
食物中葡萄糖的測定
內容
葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產生葡萄糖酸和過氧化氫,過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯甲苯胺生成藍色物質,此有色物質在625nm波長下與葡萄糖濃度成正比。通過測定藍色物質的吸光度可計算樣品中葡萄糖的含量。
2.適用范圍
適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食物樣品和血液樣品。檢出量為0.02 mg。
3.儀器
722分光光度計。
4.試劑:
除特殊說明外,實驗用水為蒸餾水,試劑為分析純。
(1) 乙醇。
(2) 40% 三氯乙酸:稱取40g 三氯乙酸,用水溶解并稀釋至100ml。
(3) 2 mol/L NaOH 溶液:稱取8g NaOH, 用水溶解并稀釋至100ml。
(4) 1 % 鄰聯甲苯胺溶液:稱取0.1 g 鄰聯甲苯胺溶解于10 ml無水乙醇中,倒入棕色瓶中,4 ℃ 冰箱保存。
(5) 乙酸緩沖液 (pH 5.0):稱取14.28 g 乙酸鈉 (CH3COONa?3H2O)溶于水中,加入2.7 ml冰乙酸,并調節pH 5.0, 用水定容至1 L。
(6) 葡萄糖氧化酶溶液:稱取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma 公司)用水溶解,使酶含量為100 U/ml。4 ℃冰箱保存一周。
(7) 過氧化物酶溶液: 0.010 g 辣根過氧化物酶溶于10 ml 水中,4 ℃ 冰箱保存一周。
(8) 酶溶液:取100 ml 乙酸緩沖液,分別加入鄰聯甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各1 ml,混勻。4℃冰箱可保存七周。
(9) 酶空白液:取100 ml 乙酸緩沖液,分別加入鄰聯甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各1 ml,混勻。4℃冰箱保存一周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)
(10) 葡萄糖標準液:將葡萄糖標準品(純度大于99%)于80 ℃干燥至恒量。精確稱取0.050 g,用水移入100 ml容量瓶中,定容至刻度線。相當于濃度為0.5 mg/ml。
5.操作步驟:
5.1樣品處理:
(1)固體樣品:稱取0.5~5g已粉碎的樣品于錐形瓶中,加入50ml水后沸水浴15min。冷卻后,轉移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反復搖動混勻樣品,過濾,棄初始幾滴濾液。收集濾液。如果濾液澄清,可直接或經進一步稀釋后用于測定。如果濾液渾濁,吸取20ml濾液轉移至另一容量瓶中,加入無水乙醇至刻度?;旌虾箪o置至少30min。過濾,濾液用于測定。
(2)液體樣品,寡糖、淀粉等碳水化物水解液:吸取2~10ml樣品或水解液,加入4倍量乙醇,混和。靜置至少30min,過濾后濾液備用。(如果過濾后濾液仍渾濁,或樣液體積過少,可3000rpm離心15min,上清液備用。)
(3) 新鮮牛乳等樣品:吸取0.5~2ml 樣品,用水稀釋,加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml,過濾。吸取5ml濾液,用2 mol/L NaOH 調節pH至中性,用水定容至10ml,備用。
(注:樣品處理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白質,40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。)
5.2測定:標準管和樣品測定管,按下表所列操作(單位:ml)
試 劑
標準空白管
葡萄糖標準管
樣品空白管
樣品測定管
葡萄糖標準液
——
0.1~0.5
——
——
樣品提取液
——
——
0.5
0.5
水
0.5
補至0.5
——
——
酶溶液
5
5
——
5
酶空白液
——
——
5
——
上述試劑混合后37℃ 水浴反應 15 min, 625 nm 測定吸光度值。
(注意:葡萄糖與酶溶液的成色反應與反應時間密切相關,如反應時間過長,溶液顏色會由藍轉變成灰色,并慢慢產生沉淀,所以反應時間應嚴格控制好。)
6.計算
根據吸光度值求出葡萄糖標準曲線的回歸方程,采用插入法求出樣品測定管中葡萄糖含量,再根據稀釋定容體積和稱樣量,計算出樣品中葡萄糖含量。
計算公式:
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——樣品中葡萄糖含量,g/100g;
As—— 由標準回歸方程求出的樣品測定管中葡萄糖含量,mg;
Ab——由標準回歸方程求出的樣品空白管中葡萄糖含量,mg;
V——樣品定容體積,ml;
F——稀釋倍數
0.5——測定時吸取樣品提取液的體積,ml;
m——樣品質量,g;
0.1——將mg/g轉換成g/100g的系數。
7.注意事項
(1) 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應,特異性強,靈敏度高。
(2)如果樣品提取液為無色,無需做樣品空白。但是有些樣品顏色很深,如飲料、菌藻類食物,或樣品提取液渾濁,往往干擾測定結果但又難以去除,所以測定這類樣品時需做樣品空白管以減少干擾。
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