一、反相色譜柱的選擇
1．柱子的PH值使用范圍
反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動(dòng)相的PH值小于2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解；當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。如果流動(dòng)相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí)，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。
2．填料的端基封尾（或稱封口）
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對(duì)極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介紹—極性封尾C16固定相柱
戴安公司有28種類型的柱子，Acclaim反相柱填料高純，金屬含量極低，完全封尾。PH2-9范圍內(nèi)兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim極性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O鏈接鍵的色譜柱，具極低的硅羥基活性，能在極性溶劑甚至100%水的條件下長(zhǎng)期使用。對(duì)酸性和堿性化合物有極為尖銳的好的色譜峰形，與現(xiàn)有的一流色譜柱相比有更好的立體選擇性。（下圖是Acclaim極性封尾C16柱和市售極性封尾一流色譜柱分離酸性化合物譜圖的比較）

二、液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
b．流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
c．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

三．色譜柱的維護(hù)
1.色譜柱的平衡
　反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)！操作步驟：
a.平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來平衡）
b.如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。
2．色譜柱的再生
長(zhǎng)期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。　
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
　　色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積
　　125-4mm1.6ml30ml
　　250-4mm3.2ml60ml
　　250-10mm20ml400ml
選擇再生方法：
　　極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：
　　正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
　　非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水
注意：
　　a.在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。
　　b.0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡(jiǎn)單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
3.色譜柱的維護(hù)
a．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）
b．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c．避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
d．流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。