一：吸光光度法
基于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光波具有選擇性吸收的能力而建立起來的分析方法。
（一） 光線：
光線的波長(zhǎng)： 200nm-400nm 紫外線*
400-750nm可見光*
>750nm 紅外線
光具有波粒二相性，波長(zhǎng)不同，其能量不同。
（二） 物質(zhì)的吸收光譜及顏色：
1． 物質(zhì)的原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜：原子的最外層電子可以選擇性吸收特征波長(zhǎng)的電磁波成為
激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的光譜稱為原子吸收光譜。激發(fā)態(tài)原子恢復(fù)到基態(tài)，則釋放出特征波長(zhǎng)的光子，形成原子發(fā)射光譜。不同的溶液其光譜不同，即不同溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光其吸收能力不同，對(duì)某一特定波長(zhǎng)的光存在吸收峰。
2． 可見光由赤橙黃綠青蘭紫等能量不同的光線組成，當(dāng)可見光穿過某一溶液時(shí)，由于特定波長(zhǎng)的
光被吸收而使溶液呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色。（如CuSO4由于吸收了可見光中的黃光(600nm)而成藍(lán)色）不同顏色的溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光其吸收能力不同。
（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行單色光（Io）通過有色的透明溶液時(shí)，一部分的光可以透過溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,還有一部分被器皿表面反射（Ir）,則：
Io=It+Ia+Ir 。那么，該溶液透光率為: T = It / Io 。
1． Lambert 定律：設(shè)有一束平行單色光,通過液層厚度為b 的均勻透明溶液,則溶液對(duì)光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b
k2 為吸光系數(shù)，為常數(shù)。與入射光波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)、濃度和溫度有關(guān)；A 為吸光度（又稱光密度
O.D 或消光度E），當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的濃度和溫度一定時(shí)，A 與b 成正比。
2． Beer 定律：設(shè)有一束平行單色光,通過濃度為c 的均勻透明溶液,則溶液對(duì)光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4c
k2 為常數(shù)。由Beer 定律可知：當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的厚度和溫度一定時(shí)，A 與c 成正比。
3． Lambert-Beer 定律：綜合1.2.得： A=Kbc ,
即：當(dāng)入射光波長(zhǎng)、吸光溶液的性質(zhì)和溫度一定時(shí)，A 與b、c 成正比。
（四） 吸光光度法的基本原理：
1、 不同物質(zhì)，由于其分子結(jié)構(gòu)和原子組成不同，故對(duì)光的吸收光譜不同（如：CuSO4），在測(cè)定不同顏
色的物質(zhì)濃度時(shí)要用最大吸收的波長(zhǎng)的入射光，這樣測(cè)量的靈敏度最高。
2、 同一種物質(zhì)，若濃度不同，則對(duì)同一波長(zhǎng)的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比關(guān)系。
3、 應(yīng)此，利用特定波長(zhǎng)的單色光（通常用最大吸收波長(zhǎng)的入射光）照射不同濃度的某一溶液時(shí)，所得的吸光度大小應(yīng)與溶液濃度呈線性關(guān)系，故可利用該線性關(guān)系通過計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線來求得未知溶液的濃度。
（五） 吸光光度法特點(diǎn)：
1． 靈敏度高：mg%級(jí)、甚至ug%級(jí)。
2． 準(zhǔn)確度高：誤差2-5%
3． 操作簡(jiǎn)便、快速，儀器設(shè)備不復(fù)雜，價(jià)格低廉，故應(yīng)用廣泛。
二 ：分光光度計(jì)的使用：
（一） 分光光度計(jì)的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱鏡或光柵等分光器獲得純度較高的單色光
來測(cè)量未知溶液的濃度的方法。
（二） 常用分光光度計(jì)：可見光、紫外、紅外分光光度計(jì)，
熒光分光光度計(jì)，火焰分光光度計(jì)等。
（三） 722 型分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)（略）
（四） 722 型分光光度計(jì)的使用及注意事項(xiàng)
1、 插上插頭，接通電源，打開暗箱蓋，預(yù)熱20min。
* 注意：分光光度計(jì)在接通電源而不用時(shí)，必須打開暗箱蓋，以免光電管老化。
2、 將準(zhǔn)備好的試劑倒入比色杯中，用吸水紙擦去比色杯外側(cè)水珠，并依次放入比色杯架中。
* 注意：手拿比色杯毛面，試劑倒入杯中滿2/3 即可，不得將比色杯放在儀器上。
3、 調(diào)節(jié)所需波長(zhǎng)，靈敏度調(diào)至“1”，選擇旋鈕至“T”。
4、 調(diào)“0”：打開暗箱蓋，用調(diào)“0”旋鈕調(diào)節(jié)。
5、 調(diào)“100%”：蓋上暗箱蓋，用調(diào)“100%”旋鈕調(diào)節(jié)，讓光線通過“空白管”。
6、 重復(fù)調(diào)“0”和調(diào)“100%”數(shù)次。
* 注意：若調(diào)不到“0”和“100%”，可將靈敏度調(diào)至“2”或更高，不得用力強(qiáng)行旋轉(zhuǎn)旋鈕，以免損壞。
7、 將選擇選扭由“T”調(diào)至“A”，此時(shí)讀數(shù)應(yīng)由“100”至“0”，若不為“0”，可用“消光零”旋鈕調(diào)節(jié)。
8、 拉動(dòng)拉桿，分別讀取“A 標(biāo)”和“A 樣”。
9、 取出比色杯，棄去溶液，洗凈晾干，備用。
（五） 計(jì)算
1．利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物含量：
A 樣=K 樣b 樣c 樣
A 標(biāo)=K 標(biāo)b 標(biāo)c 標(biāo)
因?yàn)槿肷涔獾牟ㄩL(zhǎng)，溶液性質(zhì)和溫度以及比色杯的
厚度都一樣，即：K 樣=K 標(biāo) b 樣=b 標(biāo)
所以：A 樣/ A 標(biāo)= c 樣/ c 標(biāo)
得：c 樣= c 標(biāo)×A 樣/ A 標(biāo)
2． 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算：
3． 偏離Lambert-Beer 定律的原因
1） 由于非但色光引起的偏離。
2） 由于溶液本身原因引起的偏離：
① 由于介質(zhì)不均勻引起的偏離
② 由于溶液中化學(xué)反應(yīng)引起的偏離
三：實(shí)驗(yàn)：CuSO4 濃度的測(cè)定
C 標(biāo)= 比色波長(zhǎng)=650nm
比色結(jié)果： A 標(biāo)= A 樣=
計(jì)算：C 樣=C 標(biāo)*A 樣/A 標(biāo)